Phenotype Microarrays für Mikroorganismen

Phänotypanalyse von Mikroorganismen

Mit den Phenotype MicroArrays (PMs) bieten wir die Möglichkeit metabolische Eigenschaften von Bakterien, Hefen und Schimmelpilzen phänotypisch darzustellen.

In der Vergangenheit wurden die Phänotypen jeweils einzeln gemessen. Was gebraucht wurde, war eine Möglichkeit, hunderte oder tausende von Phänotypen auf einmal zu messen. Die Methode zur Erreichung sollte idealerweise für alle Zellen funktionieren und so einfach und kostengünstig wie möglich sein. Somit wurde eine Methode entwickelt zur Analyse von Zellphänotypen, welche für aerobe und anaerobe Bakterien, Hefen sowie Schimmelpilze funktionieren sollte.

Es wurde ein Standardsatz von fast 2000 Tests entwickelt, die für einer sehr hohen Vielzahl von Bakterienarten produktiv eingesetzt werden kann.

Wie in der Abbildung gezeigt, besteht das Set aus:

• etwa 200 Assays zum C-Quellen-Stoffwechsel
• 400 Assays zum N-Quellen-Stoffwechsel
• 100 Assays des P-Quellen- und S-QuellenStoffwechsel
• 100 Assays zu Biosynthesewegen
• 100 Assays von Ioneneffekten und Osmolarität
• 100 Assays von pH-Effekten und pH-Kontrolle mit Deaminasen und Decarboxylasen
• 1000 Assays zur chemischen Empfindlichkeit.

In den Tests zur chemischen Empfindlichkeit Assays gibt es 240 verschiedene Chemikalien, jede in vier Konzentrationen. Es wurden hier Chemikalien ausgewählt, die für die meisten Mikroorganismen toxisch sind und die durch Interferenz verschiedene zelluläre Signalwege stören. Zum Beispiel die DANN Replikation, RNA-Transkription, Proteinsynthese, Zellwand Synthese, Zellmembransynthese, Nährstofftransport, etc. Um auch in der Natur vorkommende Chemikalien abzudecken, wurden auch Tests zur Messung der Empfindlichkeit von Bakterien gegenüber zahlreichen anorganischen

Chemikalien, wie Kationen (Na1, K1, Fe31, Cu21, Co21, Zn21, Mn21, etc.) und Anionen (Chlorid, Sulfat, Chromat, Phosphat, Vanadat, Nitrat, Nitrit, Selenit, Tellurit, usw.) entwickelt.

Das Phenotype MicroArray System besteht aus zwei Komponenten, die kombiniert werden müssen, um den Test zu starten. Die erste ist eine Suspension von Zellen. Die Bakterien werden zunächst auf einem universellen Agarmedium für copiotrophe Bakterien kultiviert (z.B. Biolog Universal Growth

Agar mit Blut (BUG1B). Es können aber auch andere Medien verwendet werden – z.B. ist R2A-Agar ein gutes allgemeines Medium für oligotrophe Bakterien). Anschließend wird ein Wattestäbchen zur Herstellung einer Zellsuspension mit einer standardisierten Zelldichte hergestellt. Die Zellsuspension enthält einige Salze, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten, und einen

Tetrazolium-Redox-Farbstoff zur Messung der Zellatmung. Durch die Stoffwechselaktivität wird der Farbstoff schließlich reduziert und ändert seine Farbe von farblos zu violett. Je nach metabolischer Aktivität ist die Färbung stärker oder schwächer.Dieses Inokulum wird einfach in die Wells der 20 Mikrotiterplatten (PM1-20) pipettiert. In die Wells sind die jeweiligen Substrate, Nährstoffe oder Chemikalien eingetrocknet und lösen sich mit der Zugabe der Zellsuspension.