Phenotype MicroArrays Biolog

Metabolismus Analyse

Phenotype MicroArrays (PMs) von Biolog stellen neben der Nukleinsäure-Analyse (Genomics) und der Protein-Analyse (Proteomics) die dritte große Technologie dar, die im genomischen Zeitalter der Forschung und Medikamentenentwicklung benötigt wird. Genauso wie DNA-Microarrays und Proteomic-Technologien es ermöglicht haben, das Niveau von Tausenden von Genen oder Proteinen auf einmal zu bestimmen, ermöglichen Phenotype MicroArrays die quantitative Messung von Tausenden von zellulären Phänotypen an lebenden Zellen auf einmal.

Die Phenotype MicroArray-Technologie ermöglicht es Forschern, fast 2000 Phänotypen einer mikrobiellen Zelle in einem einzigen Experiment zu bewerten. Durch die umfassende und präzise Quantifizierung von Phänotypen sind Forscher in der Lage, eine unvoreingenommene Perspektive der Auswirkungen von genetischen Unterschieden, Umweltveränderungen und der Exposition gegenüber Medikamenten und Chemikalien auf Zellen zu erhalten.

Hier finden Sie eine Übersicht der gängigsten Substrate und Platten.
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Wie wird Zellatmung bzw. die Stoffwechselaktivität sichtbar gemacht?

Die Technologie verwendet einen Tetrazolium-Farbstoff, zum kolorimetrischen Nachweis der Atmung / Zellaktivität von Zellen. Die Reduktion dieses Farbstoffs führt zur Bildung einer violetten Farbe und da die Reduktion des Farbstoffs unter physiologischen Bedingungen im Wesentlichen irreversibel ist, reichert er sich über einen Zeitraum von Stunden in den Wells der Platten an und verstärkt das Signal und integriert die Menge der Zellatmung über die Zeit.

Dies bietet mehrere wesentliche Vorteile:
– Der Farbumschlag ist leicht zu quantifizieren
– Der Farbumschlag ist sehr empfindlich und hoch reproduzierbar
– Die Zellatmung kann unabhängig vom Zellwachstum erfolgen
– Und kann in einigen Fällen Phänotypen messen, die nicht zum Wachstum führen würden

Abbildung: Koordinierte Verknüpfung von Stoffwechselwegen. Schematische Diagramm der wichtigsten Stoffwechselwege in Bakterien und wie ihre Aktivitäten in eine kolorimetrische Ansicht umgewandelt werden. Eine Kohlenstoff-Quelle, die in eine Zelle transportiert und zu NADH verstoffwechselt werden kann, erzeugt ein Redoxpotential und einen Elektronenfluss zur Reduktion des Tetrazolium-Farbstoffs, wodurch eine violette Farbe erzeugt wird. Je schneller dieser Stoffwechselfluss ist, desto schneller wird die violette Farbe gebildet. Viele Zellen weisen jedoch ein Phänomen der Checkpoint-Kontrolle auf, bei der der Abbau der C-Quelle eingeschränkt ist, wenn die Zelle nicht auch über ausreichende Mengen an N, P und S verfügt. Dies ermöglichen weitere Assays, bei denen man auch diese Stickstoff-, Phosphat- und Schwefel Abbaupfade messen kann.

Warum die Zellatmung statt des -wachstums messen?

Wie beschrieben, messen Phenotype MicroArrays zelluläre Phänotypen kolorimetrisch mit einem Tetrazolium-Redox-Farbstoff zur Messung der Zellatmung. Wieso sollte nun die Zellatmung anstatt des Zellwachstums gemessen werden?

Dafür gibt es mindestens drei Gründe.

1. Es ist ein empfindlicherer Weg, um Phänotypen zu messen. Zellen können metabolisch reagieren indem sie atmen, aber nicht wachsen. Zum Beispiel zeigen Staphylococcus Spezies eine respiratorische Antwort auf Stickstoffquellen-Quellen, aber Wachstum kann durch einzelne N-Quellen nicht gefördert werden.
2. Es erlaubt die Messung von mehreren zellulären Stoffwechselwegen. Zum Beispiel hat E. coli einen Formiat-Dehydrogenase Weg, der durch Atmung, aber nicht durch Wachstum nachgewiesen werden kann. Es kann atmen und mit Formiat Energie erzeugen, aber es kann nicht auf Formiat wachsen, weil es nicht in der Lage ist, diese Kohlenstoff-Verbindung in größere Moleküle umzuwandeln, die es zur Replikation benötigt.
3. Es kann verwendet werden zur Messung von Phänotypen von Zellen, die nicht axenisch kultiviert werden können, zum Beispiel Coxiella-Arten, die innerhalb von eukaryotischen Zellen kultiviert werden müssen.